香蕉喜温畏寒，在我国主要生产地是亚热带地区，属于对低温敏感的植物，在生产过程中很容易受到白然气候的影响，当冬春寒潮入侵时，在种植香蕉的北部边缘地区，由于气温骤降极容易发生低温冻害、寒害，制约着香蕉产业的健康发展。

为了探究香蕉抗寒机制，我们以香蕉为试验材料，研究不同激素及低温对香蕉抗逆性及生理指标的影响，及利用qRT-PCR技术检测 nsLTP 基因对低温胁迫的响应。

nsLTP基因对香蕉的影响

根据香蕉基因组数据，利用Tbtools 软件对香蕉 nsLTP 基因家族成员的染色体定位情况进行分析,从图2-5 可看出,香蕉nsLTP 基因家族成员在染色体 Chr5.Chr7、Chr11各分布1个，在染色体 Chr1、Chr9 各分布2个，在染色体 Chr6 分布3个,在染色体 Chr10 分布4个,在染色体 Chr2、Chr4 各分布5个。香蕉 nsLTP基因家族成员的染色体分布均匀且无序。

MansLTP 家族成员中具有大量核心启动子TATA-box 和增强子元件 CAAT-box，启动子上游区域中还具有 23 种顺式调控元件，其中包括脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯、赤霉素、生长素等激素调控元件:低温胁迫、厌氧诱导、缺氧特异性诱导等胁迫响应元件:蛋白结合位点、种子特异性、胚乳特异性、玉米蛋白代谢等生长发育相关元元件。

MasLTP 基因家族主要与植物激素和低温胁迫有关，在对MasLTP家族成员启动子顺式作用元件分析中发现，MansLTPL1、MansLTPIL1、MansLTPL3、MansLTPL7、MansLTPI.9、MansLTP1.8、MansLTPIV.5 响应低温胁迫元件:除 MansLTPL9、MansLTPL.12、MasLTPV.!外，其他家族成员均响应 MeJA 调控元件:除 MansLTPL9 外，其他家族成员均响应 ABA 调控元件:MansLTPIV.1、MansLTPI.4、MansLTPIV.2、MansLTPL3,MansLTPL9,MansLTP4、MansLTPI. 3、MansLTPV.1、MansLTPL12MansLTPV.2 响应赤霉素调控元件:所有家族成员均具有光响应元件。

我们通过对香蕉A基因组数据库进行筛选鉴定，最终得到25个nsLTP 家族成员，在不同物种中，sLTP 家族成员数量不同，模式植物拟南芥中鉴定出49个，水稻中鉴定出 52 个，nsLTP 基因家族可分为9个亚族，但 MansLTPVII、MansLTPVII、MansLTPIX在进化中丢失，故MansLTP 仅分为6个亚族，其进化方式与拟南芥和水稻相近，根据nsLTP系统进化树观察结果，其中7种nsLTP在拟南芥、水稻中存在，香蕉中没有第七、八、九类 nsLTP，拟南芥中没有第七类 nsITP，第九类 nsLTP 仅在拟南芥中被鉴定，再一次验证了前人的结论，nsLTP家族的主要功能多样化早于单叶/双叶分化。

对香蕉 nsLTP 基因家族进行生物信息学分析，亚细胞定位结果显示，16个基因定位在细胞外部，1个基因定位在线粒体外膜，1个基因定位在细胞质，1个基因定位在内质网，6个基因定位在液泡，亚细胞定位不同，基因在植物中发挥的作用可能不同:对香蕉nsLTP 家族成员保守基序进行分析，同一个亚族的大部分成员存在相同的motif，表明同一个亚族的基因具有极高的保守性。

植物激素是植物合成的微量有机物质,对植物生长有显著影响，对 MansLTP基因家族成员进行启动子顺式元件分析，MasLTP基因家族成员含有各种激素响应元件和低温胁迫响应元件,这与前人研究的 nsLTP 基因功能一致，一些研究表明，nsLTP 基因可以响应某些信号分子，如脱落酸、水杨酸等。

因为植物不能移动,所以它们必须承受干旱、盐度和极端温度等非生物胁迫，这些胁迫极大地限制了植物的分布，改变了植物的生长和发展，降低了作物的生产力，Hairat 等人报道了两个小麦基因，TaLTP40和 TaLTP75 在寒冷、千早和盐胁迫下高表达，而且过表达小麦 LTP 基因的转基因对非生物胁迫具有更高的耐受性。

研究表明，在转基因拟南芥中发现了3种型 TaLTPS，能提高其抗寒性15，IaDIR1-2 的表达在水杨酸(SA)或低温处理的小麦幼苗中显著上调m6.过表达 SinsLTP!的转基因马铃薯株系对高温、缺水和盐胁迫的耐受性增强!7.转录组分析表明，BnLTP 基因参与了甘蓝型油菜对高温、干旱、NaC1、低温、吲哚乙酸和 ABA 等多种非生物胁迫的响应。

MansLTP 在不同激素处理下表达模式分析

使用 qRT-PCR 检测香蕉叶片在 ABA 处理下 MansLTP 基因家族6个成员的表达情况，结果显示，在 ABA 处理下MansLTPL1、MansLTPL.5、MansLTPIV.3 均在12h时表达量显著高于其他时间段，而MansLTPL.4在 8h时表达量显著高于其他时间段:MansLTPLI表达量在 0-8h呈下调趋势，在8-12h呈显著上调趋势，在12-24h呈显著下调趋势，在24-48h呈显著上调趋势，在8-12h呈显著下调趋势，在12-24h呈显著下调趋势，在24-48h呈上调趋势,在 8-24h 呈整体显著下调趋势,MansLTP1.4表达量整体呈先上调后下调趋势:MasLTP.5 表达量在 0-8h 呈显著上调趋势。

在 8-12h 旱显著上调趋势,在 12-24h呈显著下调趋势，在 24-48h呈上调趋势，在0-12h呈整体显著上调趋势，MasLTP1.5 表达量整体呈先上调后下调趋势:MansLTPII表达量整体呈先上调后下调趋势，在 12h时相对表达量达最大，在0-8h、8-12h 呈显著上调趋势，在 12-24h、24-48h呈下调趋势，其中12-24h呈显著下调趋势:MansLTPIV.3表达量在 0-8h 呈上调趋势。

在 8-12h 呈显著上调趋势，在 12-24h 呈显著下调趋势，在 24-48h 呈下调趋势，在 0-12h 呈整体显著上调趋势，MasLTPIV.3 表达量整体呈先上调后下调趋势:MansLTPIV5表达量在 0-8h呈显著上调趋势，在8-12h呈显著下调趋势,在 12-24h 呈上调趋势,在24-48h呈显著下调趋势,MansLTPIV.5表达量整体呈“M”型变化趋势。综上，MasLTP基因家族大部分成员在外源ABA的处理下整体呈现显著上升趋势，并且表达量显著，展现该家族的功能性。

使用 qRTPCR 检测香蕉叶片在 MeJA 处理下 MansLTP 基因家族6个成员的表达情况，结果显示(见图 3-2)在 MeJA 处理下 MansLTP11、MansLTP14、MasLTPL.5 均在 0h时表达量高于其他时间段,而 MansLTPIV3在 48h 时表达量高于其他时间段:MasLTPL.I表达量在 0-8h 呈显著下调趋势，在8-12h呈上调趋势，在 12-24h 较为稳定，在 24-48h呈上调趋势，MansLTPLI表达量呈先上升后下降趋势,但整体呈下调趋势:MansLTP1.4表达量在 0-8h 呈下降趋势,在 8-12h较为稳定，在 12-24h 呈下调趋势，在 24-48h 呈下调趋势，MansLTP1.4 表达量整体呈下降趋势:MasLTPL5 表达量在 0-8h呈显著下调趋势，在8-12h呈显著上调趋势，在 12-24h呈显著下调趋势，在24-48h呈上调趋势。

MansLTP.5表达量整体呈现“W”趋势，但最终低于初始表达量:MansLTPII表达量整体呈先上调后下调趋势，在 8h时相对表达量达最大，在 0-8h呈显著上调趋势，在8-12h、24-48h 呈显著下调趋势，12-24h呈下调趋势:MansLTPIV3表达量在 0-8h 呈下调趋势，在 8-24h 呈显著上调趋势，在24-48h呈显著上调趋势，MansLTPIV3表达量整体呈先下调后上调趋势:MansLTPIV5表达量在0-8h呈显著下调趋势，在 8-12h 呈显著上调趋势，在12-24h 呈显著下调趋势，在 24-48h 呈显著上调趋势，MansLTPIV.5 表达量整体“W”变化趋势，在12h时表达量最高，MansLTP 基因家族大部分成员在外源 MeJA 处理下呈现下调趋势，表达显著。

结语

基于香蕉 A 基因组数据库，筛选得到 25 个nsLTP 基因家族成员。对该家族成员进行理化性质预测,成员的氨基酸长度在91~119个之间,等电点在 5.68~9.91之间，酸性蛋白有4个，碱性蛋白有21个，进行亚细胞定位分析，可得大部分成员定位在细胞外部，少部分定位在线粒体外膜、液泡、细胞质、内质网(膜)，可能与 nsLTP 蛋白运输脂质有关。

启动子顺势元件分析可得，MansLTP 家族成员中具有大量核心启动子 TATA-box 和增强子元件 CAAT-box，启动子上游区域中还具有 23 种顺式调控元件，其中包括脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯、赤霉素、生长素等激素调控元件;低温胁迫、厌氧诱导、缺氧特异性诱导等胁迫响应元件，MansLTP 基因家族主要与植物激素和低温胁迫有关。

qRT-PCR 结果显示:相比于 MeJA，香蕉nsLTP 对于 ABA 的响应更大，而且不同基因对于 ABA的响应程度也不同,其中 MansLTPL.4能有效响应外源 ABA处理，并且表达量最高，推测该成员在调控ABA 的表达中具有重要作用。而对于外源 MeJA 激素处理，大部分的成员呈现下调趋势，小部分的成员呈现略微上调趋势，不同成员之间存在着不同的调控模式。

在根茎叶的低温处理中，除了MasLTPI.3，其他成员均正向响应低温。在低温以及低温施 SA 处理中，MansLTP1.4 在 12h 时，低温喷施 SA 处理的表达量低于低温处理的表达量，在24h 时，低温喷施 SA 处理的表达量显著高于低温处理的表达量。结合处理时的表型变化，可推测在低温处理时喷施 SA 激素能提高香蕉对低温胁迫的抗性。

通过启动子顺式作用元件分析预测出 MasLP1.3 启动子包含低温胁迫元件、茉莉酸甲酯(MeJA)元件、脱落酸(ABA)元件。构建 MansLTP1.3基因启动子过表达载体，瞬时注射烟草，并对烟草进行 ABA、MeJA 以及低温处理，使用 qRT-PCR 技术，分析其是否响应。

结果表明:ABA 和MeJA 均能促进proMansLTP13启动子驱动 GUS 基因的表达，其中 ABA 处理后，GUS 的相对表达量是对照组的 1.72倍，MeJA 处理后，GUS的相对表达量是对照组的 2.81倍，推测 proMansLTP1.3启动子均能响应 ABA 和MeJA 处理,而且MeJA比ABA 处理更能促进 proMansLTP13启动子驱动GUS 的表达。4℃C低温处理 24h后，GUS的相对表达量是对照组的 11.05 倍，低温胁迫能促进proMansLTPL3 启动子驱动 GUS 的表达，推测 proMansLTPL3 启动子能响应低温胁迫。